小胶质细胞在决定肌萎缩侧索硬化症(ALS)的进展中起着关键作用，但它们在人类ALS中的确切作用尚未确定。本研究旨在通过诱导小胶质细胞模型确定与快速进展的散发性ALS患者小胶质细胞功能特征相关的关键因素，尽管它与脑内小胶质细胞不相同。在确认人类单核细胞诱导的小胶质样细胞(iMGs)能够概括脑小胶质细胞的主要特征后，我们进行了逐步的比较研究，以描绘慢进展性ALS [ALS(S)， n=14]和快速进展性ALS [ALS(R)， n=15]患者的iMGs功能差异。尽管小胶质细胞稳态基因的表达没有显著差异，但与ALS(S)-iMGs相比，ALS(R)-iMGs优先表现出吞噬缺陷和对LPS刺激的过度促炎反应。转录组分析显示，ALS(R)-iMGs中出现的吞噬紊乱与NCKAP1 (nck相关蛋白1)介导的异常肌动蛋白聚合减少密切相关。NCKAP1过表达足以挽救ALS(R)-iMGs中受损的吞噬功能。事后分析表明，img中NCKAP1表达的降低与ALS的进展相关。我们的数据表明，小胶质细胞NCKAP1可能是快速进展的散发性ALS的替代治疗靶点。

　　肌萎缩性侧索硬化症(ALS)是一种致命的神经退行性疾病，其特征是运动神经元的丧失和运动神经轴的炎症，包括初级运动皮层、脑干和脊髓。它会导致肌肉无力、消瘦、呼吸麻痹，并最终在3 - 5年内死亡[1]。

　　ALS的临床进展变化很大。小胶质细胞在ALS临床进展中起着至关重要的作用[2]。在SOD1突变小鼠模型中，小胶质细胞的双重作用(即根据疾病分期有保护作用或毒性作用)已经得到了充分的描述[3,4]。然而，大多数ALS病例是散发性的(sALS)， SOD1突变小鼠模型的结果不足以描述散发性ALS的小胶质细胞功能。此外，与SOD1突变小鼠模型相比，反应性小胶质细胞吞噬在TDP-43蛋白病变模型中表现出神经保护作用，而不是加剧运动神经元死亡，TDP-43蛋白病变是sALS中最常见的病理。此外，先前针对ALS患者使用抗炎药物的临床试验结果表明，完全抑制小胶质细胞功能似乎与神经炎症过程的最佳控制无关[7,8]。这些发现表明，神经炎症的性质在病理条件下是不一致的。这似乎取决于刺激的类型、持续时间和涉及的区域[9]。此外，除了小胶质细胞[10]和星形胶质细胞[11]等非神经元细胞外，外周单核细胞也参与了ALS的炎症过程和免疫功能障碍[2,12]。最近的证据表明，外周单核细胞有助于ALS的进展速度[13]，调节它们的炎症活性可以改善小鼠ALS[14,15]。这些发现为神经炎症的过程提供了重要的见解，神经炎症是由复杂的综合形式而不仅仅是分离的方式引起的。

　　最近的研究表明，小胶质细胞可分为不同的小胶质细胞亚型，这取决于周围的炎症环境或其来源[16]。尽管基于单细胞检测了解每个小胶质亚群在ALS中的作用很重要，但实际上不可能基于单细胞检测评估活体ALS患者中伴随复杂炎症过程的原位小胶质细胞和其他细胞的整体功能状态。虽然诱导多能干细胞(iPSCs)和共培养模型已被用于研究小胶质细胞[17,18,19]，但ipsc衍生的小胶质样细胞存在缺陷;例如，它们不能反映由于返老还老而导致的当前病理状态[20]。此外，它们需要复杂的程序，重编程效率低，需要很长时间才能生长和研究[21,22,23]。另一方面，单核细胞诱导的小胶质样细胞(iMGs)有一个优势，它们反映了中枢神经系统吞噬细胞当前的病理生理状态[22,24,25]。尽管img与卵黄囊来源的小胶质细胞不完全相同，但至少在一定程度上可以作为解释活体患者的人类小胶质细胞病理的模型系统[21,24,25,26]。

　　小胶质细胞反应有时会导致意想不到的和相反的结果，这取决于疾病的阶段和当前的病理损伤。因此，针对小胶质细胞的治疗策略应该针对其受影响的功能途径，而不是针对特定疾病状态的不同分子特征和表型。我们的先验假设是ALS的进展速度可能与小胶质细胞的吞噬功能有关，动物模型和人体数据间接证实了这一点[5,10,27]。我们的假设是，小胶质细胞相关的炎症过程及其主要功能根据ALS的进展速度而不同。在先前的研究中使用外周血单核细胞(peripheral blood monocytes, PBMC)建立iMGs模型后[21,24,25]，我们的iMGs的可靠性再次得到证实，证明iMGs共享与活体ALS患者小胶质细胞先天免疫功能相关的主要基因亚群。之后，在缓慢和快速进展的ALS患者中进行了一系列比较研究，描述了iMGs的分子和功能差异，包括基因表达和吞噬功能。肌萎缩性侧索硬化症(ALS) img中有明显的吞噬功能障碍。通过转录组学分析，我们发现了一个参与吞噬功能障碍快速进展的靶分子。最后，我们确定了一个与ALS中iMGs吞噬功能缺陷相关的分子靶点。

　　我们设计了本研究，利用小胶质样细胞模型(iMGs)作为转化研究工具，根据ALS的进展速度寻找与小胶质细胞功能差异相关的关键因素。首先，iMG模型显示了健康供体小胶质细胞的特征基因模式和小胶质细胞的先天功能。为了进一步验证该模型，我们将img与从同一ALS患者获得的脑小胶质细胞进行了比较。随后，我们进行了系统的比较分析，根据临床进展的速度来描绘ALS患者img的不同性质。根据修订后的El Escorial标准[28]，所有参与者均有临床明确、临床可能或临床可能的实验室支持诊断。患者的临床信息，包括ALS功能评定量表-修订版(ALSFRS-R)评分(0 ~ 48)，前瞻性登记在数据库中。进展速度用δ FS(?FS)[29]表示(即(诊断时48-ALSFRS-R评分)/(从发病到诊断的持续时间(月))。我们在2015年9月至2017年7月期间招募了29名ALS患者和5名健康志愿者。我们暂时将在汉阳大学医院ALS/MND诊所数据库中表现出极快或极慢进展的参与者分为快速进展性ALS [ALS(R);?FS≥1.0,n=15]和缓慢进行性ALS [ALS(S)];?FS < 0.5, n=14][30,31]。在获得知情同意后，采集血样生成img，并连续进行比较研究。其次，我们努力鉴定仅存在于ALS(R)-iMGs中的与小胶质细胞功能特性相关的靶分子。为此，我们比较了ALS(R)-iMGs和ALS(S)-iMGs之间的转录组数据。随后，我们对确定的靶分子进行了功能研究。我们回顾了所有参与者的医疗记录，并将其临床特征总结在补充表1中。我们在全外显子组测序中排除了具有ALS相关基因家族史或致病变异的参与者，以排除可能的遗传影响ALS进展(补充表2)。本研究根据世界医学协会赫尔辛基宣言进行，并经汉阳大学医院伦理委员会批准(HYUH IRB 2013-06-012, 2017-01-043)。所有患者在纳入研究前均提供书面知情同意书。

　　采用Ficoll (GE Healthcare, Uppsala, Sweden)进行密度梯度离心分离pbmc。使用先前发表的方法建立iMG细胞[25]。简单地说，pbmc在RPMI-1640 (Gibco, Carlsbad, CA, USA)中重悬，含有10%胎牛血清(FBS;Gibco)和1%抗生素/抗真菌药(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)，在37°C和5% CO2下培养过夜。次日，将贴壁细胞(单核细胞)培养于添加1%抗生素/抗真菌药的rmi -1640 Glutamax (Gibco)、重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF) (R&D Systems)和重组IL-34 (IL-34) (R&D Systems)培养基中，培养iMG细胞。生成iMGs后，细胞用人CD11b-APCVio770和cd45 -藻红蛋白(PE) (Miltenyi Biotec, Gladbach, Germany)进行标记，并按照前面的描述进行流式细胞术[32]。所有数据均通过FACSCanto II流式细胞仪(BD Biosciences, Piscataway, NJ, USA)进行评估，并通过FlowJo软件进行分析。如前所述，使用定量实时聚合酶链反应(qRT - PCR)测量img中的基因表达[32]。引物信息如补充表3所示。

　　为了可视化iMGs，将细胞固定并用小胶质细胞标记物(IBA1)染色，并用DAPI(4′，6-二氨基-2-苯基吲哚)反染色。如前所述进行免疫染色[32]。抗体信息见补充表3。图像由共聚焦显微镜(TCS SP5, Leica, Wetzlar, Germany)获得。使用Imaris软件(Bitplane, Zurich, Switzerland)生成随机选择的iMG细胞(iba1阳性)的三维重建。两名盲法研究人员在确定树突长度、节段数量和分支点后，对每个重建细胞进行形态计量学分析[33]。

　　用4μl红色荧光乳胶珠在37℃下处理iMGs 24 h。用冰冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞两次，固定细胞，并用小胶质标记物(P2RY12)和DAPI染色。利用ImageJ软件统计被吞噬的珠粒数[34]。为了评估iMGs中吞噬杯的形成，将细胞与乳胶珠孵育2小时，固定，并用荧光phalloidin (1:1,000;Molecular Probes, Eugene, OR, USA)用二抗处理45分钟。抗体信息见补充表3。通过共聚焦显微镜获得图像。对于活细胞成像，img在Lab-Tek II Chamber Slide (Thermo Fisher Scientific, Rochester, NY, USA)中生长，并根据制造商的方案用100 nM的mr -actin染料(Cytoskeleton Inc.， Denver, CO, USA)进行标记。在分析前加入微珠(1.1 μm, Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA)。使用DeltaVision成像系统(Applied Precision, Bratislava, Slovakia)在5小时内每1分30秒捕获一帧图像。

　　我们证实了一名sALS患者的img的小胶质细胞特征，该患者的血液样本是在死亡前1天采集的。我们立即从同一患者的新鲜脑组织(brain- mg)中分离出小胶质细胞。患者无已知致病突变，包括FUS、C9orf72、SOD1、ALS2、SPG11、UBQLN2、DAO、GRN、SQSTM1、SETX、MAPT、TARDBP或TAF15基因突变。对于脑- mg培养，立即获得的新鲜颞中回在HBSS中清洗。然后用无菌手术刀将组织切成约1-mm3的小块，转移到含有10 ml酶解混合物的50 ml falcon管中，其中含有10 U/ml DNase (Invitrogen)和2.5 U/ml木瓜蛋白酶(Worthington, NJ, USA)，在Hibernate-A培养基(Gibco)中(每克组织)。37℃温和旋转孵育10分钟。将组织从培养箱中取出，轻轻研磨以帮助消化，然后再放回培养箱中10分钟。通过加入等体积的Dulbecco改良Eagle培养基和F-12培养基(DMEM/F12;Gibco)含1% B27 (Gibco)。细胞悬浮液通过70 μm细胞滤器(Bector Dickinson, NJ, USA)。160 × g离心10 min，丢弃上清，将细胞颗粒重悬于含1% B27、1%谷氨酰胺(Gibco)和1%青霉素-链霉素-谷氨酰胺(PSG)的20 ml DMEM/F12中;Gibco)。接下来，在细胞悬液中加入三分之一体积的冷Ficoll (GE Healthcare, Little Chalfont, UK)，在4°C下以4000 rpm离心30分钟。将含有小胶质细胞的间期转移到新管中(髓磷脂层和红细胞层被丢弃)，并用DMEM(添加10% FCS, 1% Pen/Strep, 1%庆大霉素和25 mM HEPES (Invitrogen))洗涤两次。根据制造商的方案，通过磁激活细胞分选(MACS)分别对粒细胞(仅限以前的方法)和抗cd15 -和抗cd11b偶联磁微珠(Miltenyi Biotec)进行阴性选择和小胶质细胞的阳性选择[35]。简单地说，将细胞与10 μl CD15微珠在4°C下孵育15分钟，洗涤，悬浮在头缓冲液(0.5% BSA, 2mm EDTA in PBS, pH 7.2)中，并转移到放置在磁性支架上的质谱柱上。收集含有未标记细胞的流式细胞，清洗后与20 μl CD11b微珠在4℃下孵育15 min。然后将细胞洗涤并置于磁性支架中的新质谱柱上。通过将柱从磁铁上取下，加入头缓冲液，并用柱塞清空柱来洗脱CD11b+细胞部分。急性分离的原代小胶质细胞悬浮在Trizol试剂(Invitrogen)中，保存在- 80°C。

　　我们使用抗cd14偶联磁微珠(Miltenyi Biotec)从同一患者的血液中分离出单核细胞。分离的单核细胞悬浮于Trizol试剂(Invitrogen)中，保存于- 80°C，用于RNA-seq和qRT - PCR。

　　RNA质量用Agilent 2100生物分析仪评估，使用RNA 6000纳米芯片(Agilent Technologies, Amstelveen, Netherlands)。使用SENSE 3’mRNA-Seq Library Prep Kit (Lexogen, Inc.， Vienna, Austria)按照制造商说明构建RNA文库。使用NextSeq 500平台(Illumina, Inc.， San Diego, CA, USA)进行单端75次高通量测序。使用Bowtie2 version 2.1.0对SENSE 3 ' mRNA-Seq reads进行对齐[36]。差异表达基因(differential expression genes, DEGs)是通过使用R 3.2.2版本中的EdgeR和BIOConDUCTOR 3.0版本中的EdgeR进行计数来确定的[37]。读取计数数据采用genwiz?版本4.0.5.6 (Ocimum Biosolutions，印度)，基于全局归一化方法进行处理。基因分类基于DAVID (http://david.abcc.ncifcrf.gov/)数据库检索。采用MeV 4.9.0对样本和基因进行聚类和可视化。

　　海拉细胞在Dulbecco 's MEM中培养，MEM中含有10%胎牛血清、碳酸氢钠、丙酮酸钠(Sigma-Aldrich)和抗生素。使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)按照制造商的方案，用绿色荧光蛋白(GFP)标记的人NCKAP1 cDNA或NCKAP1 shRNA转染HeLa细胞。用pgfp - c - mgfp -Human NCKAP1 (NM_013436)、cDNA ORF克隆(OriGene Technologies, Rockville, MD, USA)或pgfp - c - shlti -NCKAP1 Human shRNA慢病毒颗粒(ID 10,787)转导iMGs。转染后，采用western blotting和RT-qPCR对细胞进行评估，如前所述[32]。抗体和引物信息见补充表3。

　　根据制造商的方案，使用从Millipore (Billerica, MA)获得的市售细胞因子检测试剂盒，检测LPS刺激培养上清中促炎性和抗炎细胞因子(TNF-α， IL-1β， IL-6, IL-10和TGF-β1)的分泌情况。使用人IL-6、干扰素(IFN)-γ、IL-8、TNF-α和CCL2/MCP-1 (R&D Systems)检测ALS患者和健康对照血浆样本中的细胞因子浓度。每项测定均为三份。

　　数据以均数±标准差或扫描电镜表示。正态性由Shapiro-Wilk和Kolmogorov-Smirnov正态性检验获得。对于正态分布，组间比较采用非配对t检验或配对t检验(双尾)，而多重比较采用普通的单因素方差分析，然后采用Tukey多重比较检验(将多个治疗组与对照组进行比较)。对于非正态分布，采用Mann-Whitney U检验(双尾)进行组间比较。对于非正态多重比较，采用Kruskal-Wallis单因素方差分析(非参数)，然后进行Dunn多重比较检验(比较多个治疗组与对照组)。采用Spearman秩相关检验分析相关性。所有统计分析均使用Prism 9 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA)进行。*P < 0.05为差异有统计学意义。

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　　为了生成人iMGs，我们从5个健康对照(hc)中获得pbmc，并用GM-CSF (10 ng/mL)和IL-34 (100 ng/mL)处理21天，以诱导小胶质样细胞分支形态(iMGs)(图1a)。通过流式细胞术分析，细胞因子混合物将细胞群转向CD11b+ CD45low细胞(图1b)。在免疫荧光分析中，HC-iMGs的特征是常驻小胶质细胞表面标记物P2RY12和IBA-1表达上调，单核细胞标记物CCR2消失(图1c)。在qRT - PCR分析中，与单核细胞相比，img中的常驻小胶质特征基因P2RY12、OLFML3、TGFBR1、TMEM119和TREM2表达上调(图1d)。此外，HC-iMGs在乳胶珠刺激下表现出正常的吞噬功能，TNF-α mRNA的表达增加(图1e和f)，这与先前的研究一致，iMGs可以概括小胶质细胞的主要特征[21]。

　　图1

　　

　　为后续实验使用iMGs模型对iMGs进行表征。在第7天和第21天拍摄的不同阶段单核细胞和img的代表性图像。标尺:50 μm。b流式细胞术图显示GM-CSF和IL-34处理单核细胞21天后iMGs产生的小胶质细胞(CD45low CD11b.+)。c HC-iMGs中小胶质标记物P2RY12(绿色)、IBA-1(绿色)、单核细胞标记物CCR2(绿色)和DAPI反染(蓝色)的共聚焦图像。比例尺:25 μm。d通过qRT-PCR检测HC-iMGs中小胶质特征基因P2RY12、OLFML3、TGFBR1、TMEM119和TREM2的相对mRNA表达量。每个点代表个体来源的HC-iMGs和单核细胞的数据(n=5)。e HC-iMGs (IBA-1:绿色)与荧光乳胶珠(红色)孵育24 h, P2RY12免疫染色，作为iMG标记物(绿色)，DAPI反染(蓝色)。比例尺:25 μm。f巨噬72h后，iMGs中TNF-α mRNA的表达。每个点代表个体来源的HC-iMGs和单核细胞的数据(n=5)。数值为平均值±SEM。比较是针对控制(* * * P < 0.05, P < 0.01, * * * P < 0.001, * * * * P < 0.0001;非配对t检验或配对t检验)

　　尽管我们的数据和之前的研究结果[21,24]表明hc - img是小胶质细胞的关键特征，并显示出固有的小胶质细胞功能，但目前尚不清楚来自pbmc的img是否能准确反映同一个人的脑小胶质细胞。为了解决这个问题，我们从一位临终前同意捐献遗体的als患者身上获得了新鲜的脑组织和外周血，并立即用CD11b珠从尸检脑组织中分离出小胶质细胞。

　　为了确定iMGs和脑小胶质细胞之间的相似性，我们对iMGs、脑小胶质细胞(brain- mg, CD11b +)和单核细胞(CD14 +)进行了免疫染色和RNA测序(RNA-seq)(图2a)。DEGs分析显示，与单核细胞相比，13038个基因在img或脑- mg中存在三倍以上的差异。其中，705个(5.4%)在img和脑- mg之间重叠(图2b，补充表4)。然而，只有195个(1.5%)的富集基因在img和单核细胞之间重叠。将鉴定出的705个iMGs与brain-MG重叠基因上传到DAVID软件进行基因本体(GO)和京都基因基因组百科全书(KEGG)通路分析。氧化石墨烯分析结果显示，它们在生物过程中显著富集，包括“细胞外基质组织”、“前列腺素代谢过程”、“氧化还原过程”、“细胞迁移”和“炎症反应的积极调节”(图2c，补充表5)。KEGG途径分析显示，它们与“ecm受体相互作用”、“甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢”、“局灶黏附”、“代谢途径”和“补体和凝血级联”(图2c，补充表5)。关于小胶质特征基因[38]，img中的SPP1、JUN、TREM2、APOE、HEXB、MEF2A、LILRB4、CX3CR1、ITGAX、TGFBR1、P2RY12、MAFB、TGFB1和SLCO2B1的表达水平与脑mg相似，尽管img中的OLFML3、AXL、CSF1R、RHOB、EGR1和TMEM119的表达水平相对较低(图2d)。免疫荧光染色显示，P2RY12、IBA-1和转录因子PU.1在img和脑- mg中都得到了很好的保存，尽管img中TMEM119的免疫反应性(IR)低于脑- mg(图2e)。

　　图2

　　

　　从单个ALS患者同时获得的iMGs和脑小胶质细胞的转录组比较。用于比较肌萎缩侧索硬化症患者img与脑小胶质细胞(脑- mg, CD11b+分离)和单核细胞(CD14+分离)的实验程序示意图。b Venn图显示了根据RNA-seq在单核细胞、iMGs和脑- mg中差异表达(DE)的独特和交叉基因(13,038)(折叠变化>|3|)。c对img和brain- mg之间共有的705个基因中的10个重要通路模块和5个KEGG通路模块进行GO分析。每个条内的数字表示数据库中特定术语的基因数量。d在iMGs和brain-MG中测量的小胶质细胞特异性或富集基因的条形图[log2 (FPKM + 1)]以mean±SEM表示。e小胶质标记物如IBA-1(绿色)、P2RY12(红色)、TMEM119(红/绿)、PU.1(红色)和DAPI反染色(蓝色)的共聚焦图像。该图代表了在重复中进行的独立实验(n=10)。比例尺:25 μm

　　为了验证我们的假设，即小胶质细胞功能障碍与ALS的进展速度有关，我们招募了29名ALS患者和5名hc患者，并初步将29名ALS患者分为极快速进展的ALS [ALS(R);?FS≥1.0,n=15]或缓慢进行性ALS [ALS(S)];?FS < 0.5, n=14]。

　　本研究中，ALS(R)组平均?FS为1.6,ALS(S)组平均?FS为0.2(补充表1)。ALS(R)组平均?FS病程为13.7月，ALS(S)组平均?FS病程为53.0月。肌萎缩侧索硬化症(ALS, S)患者出现症状时年龄较轻，但两组患者iMG采样时年龄相近。两组ALSFRS-R与?FS的平均差值分别为10.2分(P < 0.001)、1.4分/月(P < 0.001)，提示ALS(R)组在采样时的临床状况恶化更严重。ALS组采样时ALSFRS-R值为27.7,ALS组为37.9。我们分析了ALS患者和hc患者的血浆细胞因子。与hc相比，两组ALS患者血浆TNF-α和IL-8水平均升高(图3a)，与既往研究一致[39]。此外，血浆IL-6和MCP-1水平仅在ALS中升高(R)。这表明血浆细胞因子在两组ALS患者之间也存在差异，提示在疾病进展中具有内在作用。

　　图3

　　

　　ALS(R)-iMGs吞噬功能受损。a 29例ALS患者血浆细胞因子水平(快速进展性ALS [ALS(R);?FS≥1.0,n=15]或缓慢进行性ALS [ALS(S)];(FS < 0.5, n=14)和hc (n=3)。b通过RT-qPCR检测ALS(R)-iMGs (n=5)和ALS(S)-iMGs (n=6)小胶质细胞特征基因的mRNA表达。每个点表示来自个体主体的img的数据。c基于imis的形态计量学分析比较三组img (IBA-1;绿色)。每列表示每组img的平均值，每个受试者衍生的img至少有十个随机选择的细胞。d用P2RY12(绿色)和DAPI反染(蓝色)免疫染色，三组大鼠灌喂红色荧光珠后的珠吞噬共聚焦图像。比例尺:25 μm。e通过每个p2ry12阳性细胞的吞噬珠数来定量。每个数据点代表每组iMGs的平均值，每个受试者衍生的iMGs至少有10个细胞(HC: n=3;ALS(S)-iMGs: n=6;ALS(R)-iMGs: n=5)。f通过qRT-PCR检测三组iMGs中p21 mRNA的表达。每个点代表来自个体受试者的iMGs数据(HC: n=3;ALS(S)-iMGs: n=6;ALS(R)-iMGs: n=5)。数值为平均值±SEM。比较是针对控制(* * * P < 0.05, P < 0.01, * * * P < 0.001, * * * * P < 0.0001;n，不显著;无配对t检验或单因素方差分析(事后Tukey检验)

　　为了进行系列比较研究，我们生成了ALS(R) (R1 - R5)和ALS(S) (S1 - S6)患者的img。在qRT - PCR分析中，与单个单核细胞相比，小胶质细胞特征基因(P2RY12、OLFML3、TGFBR1、GPR34、MERTK、HEXB、CSF1R和TMEM119)[40]在ALS(S)-iMGs和ALS(R)-iMGs中表达上调，两组表达水平无显著差异(图3b)。尽管来自两个ALS组的iMGs在小胶质特征基因的表达水平上缺乏差异，但基于imaris的形态计量学分析显示，ALS(R)-iMGs与ALS(S)-iMGs和HC-iMGs存在显著差异(图3c)。形态学参数显示，与HC-iMGs相比，两种ALS组imgs的树突长度、分节数、末端点数和分支点数均显著减少，尤其是ALS(R)-iMGs的树突长度、末端点数和分支点数明显减少。

　　进一步比较ALS(S)-iMGs与ALS(R)-iMGs的吞噬功能。最显著的发现是，ALS(R)-iMGs的吞噬功能严重受损，而ALS(S)-iMGs的吞噬功能与HC-iMGs相比没有显著差异(图3d, e)。然而，为了排除衰老相关因素影响小胶质细胞吞噬功能障碍的可能性[41]，我们发现细胞衰老标志物p21CIP1的mRNA表达没有差异(图3f)。因此，我们排除了衰老作为ALS(R)-iMGs吞噬功能障碍的一个因素。

　　为了确定与ALS(R)-iMGs吞噬功能障碍相关的负责靶点，我们分析了来自ALS(R) (R6 - R8)和ALS(S) (S7 - S10)患者的另一组iMGs的转录组学数据。在主成分分析(PCA)中，ALS(R)-iMGs与ALS(S)-iMGs明显不同(图4a)， DEGs分析(折叠变化> 1.5)显示，2559个基因在ALS(R)-iMGs中差异表达(图4b和补充表6)。对2599个基因的GO分析显示，基因亚群，包括趋化性、纤毛组装、长链脂肪酰基辅酶a生物合成、对脂多糖的反应、炎症反应、肌动蛋白丝聚合、代谢过程和吞噬作用，ALS(R)-iMGs和ALS(S)-iMGs之间表达差异(图4c和补充表7)。

　　图4

　　

　　NCKAP1与ALS(R)-iMGs的吞噬功能受损有关。3例ALS(R)和4例ALS(S)患者iMGs的转录组分析。单个ALS(R)-iMGs和ALS(S)-iMGs中所有表达基因的主成分分析(PCA)。b Venn图显示，根据RNA-seq，两组转录本的数量和重叠有显著差异(1.5倍变化)。c使用DAVID软件对2559个ALS(R)-iMGs与ALS(S)-iMGs显著改变的转录本进行功能分析(10个GO分析)。每个条内的数字表示数据库中特定术语的基因数量。d火山图显示，与ALS(S)-iMGs相比，ALS(R)-iMGs中转录本的丰度显著改变。我们测试了ALS(R)-iMGs和ALS(S)-iMGs样本之间的显著差异(突出显示)，使用1.5倍变化比截断的P值为0.05。吞噬作用氧化石墨烯基因(氧化石墨烯:0,006,909)。e通过RT-qPCR验证了与ALS(S)-iMGs相比，在ALS(R)-iMGs中鉴定为“命中”(吞噬相关丰度增加或减少)的13个转录本子集。f两组个体源性单核细胞或img中NCKAP1 mRNA的表达。符号代表个体来源的单核细胞或iMGs (ALS(R): n=5;ALS(S): n=8，来自现有样本)g从症状出现时间到img产生的采样时间点，img中NCKAP1的相对表达与疾病进展率的相关性(?FS，点数/月)。数值为平均值±SEM。与对照组比较(*P < 0.05， **P < 0.01， ***P < 0.001， ****P < 0.0001, ns，无统计学意义;非配对t检验或事后Tukey检验的双向方差分析)

　　接下来，我们关注吞噬相关基因，发现与ALS(S)-iMGs相比，ALS(R)-iMGs中NCKAP1、VAV3、MYO10、FYN、ARPCA1和SLC11A1等基因显著下调(图4d)。我们通过RT-qPCR分析了所有可用样本中13个与吞噬相关的候选转录本(图4e)。5个基因(NCKAP1、VAV3、MYO10、SLC11A1和WASp)重现了RNA-Seq结果。nck相关蛋白1 (NCKAP1)和鸟嘌呤核苷酸交换因子VAV3 (VAV3)、MYO10和Wiskott-Aldrich综合征蛋白(WASp)是已知的与吞噬过程中肌动蛋白聚合过程相关的细胞内信号调节因子[42]，在ALS(R)-iMGs中显著降低。其中，NCKAP1是在ALS(R)-iMGs中发现的与吞噬功能缺陷相关的候选基因。单个单核细胞中NCKAP1的mRNA表达水平几乎检测不到，但两组img的NCKAP1表达均高于单核细胞(图4f)。接下来，我们分析了ALS患者进展速度与NCKAP1的关系。iMGs中NCKAP1 mRNA水平与进展速度呈负相关，如?FS (r=- 0.624, p=0.0003;图4 g)。这些结果表明NCKAP1基因是反映ALS进展速度的吞噬缺陷最重要的相关因素，下一步我们将进一步研究NCKAP1基因在吞噬缺陷中的关键作用。

　　NCKAP1是WAVE调节复合体(WRC)的已知成员，通过与Arp2/3复合体的相互作用调节肌动蛋白丝重组[43]。为了进一步描述NCKAP1在吞噬作用中的作用，我们从ALS(R) (R9 - R15)和ALS(S) (S11 - S14)患者中生成了另一组iMGs。

　　首先，我们研究了NCKAP1与其他肌动蛋白聚合相关基因的关系，以及NCKAP1过表达或敲低对细胞质fmr1相互作用蛋白1 (CYFIP1)、Abelson相互作用蛋白2 (ABI2)、WASP-family verprolin同源蛋白1 (WAVE1)、WAVE2等WRC相关分子表达的影响。如图5a和b所示，NCKAP1(绿色)在ALS(S)-iMGs(白色点线框和白色箭头)吞噬过程中聚集在富含f -actin的细胞膜顶端区域(红色为phalloidin)，形成吞噬杯。吞噬杯的形成参与了吞噬初期吞噬过程中肌动蛋白在质膜下的聚合。这在用乳胶珠孵育的ALS(S)-iMGs中可以清楚地观察到。此外，富含f -actin的杯状结构与NCKAP1共定位(图5a的上图)。相比之下，ALS(R)-iMGs在与乳胶珠接触的区域表现出明显较少的吞噬杯，积累了f -肌动蛋白(图5a底部)。免疫荧光显示，WAVE复合物，如WAVE和ABI，在ALS(S)-iMGs中与NCKAP1共定位，但在ALS(R)-iMGs中没有(图5a和b)。

　　图5

　　

　　NCKAP1调控参与肌动蛋白聚合的基因，过表达NCKAP1可修复ALS(R)-iMGs中有缺陷的吞噬功能。a, b两组ALS-iMGs (ALS(S)-iMGs和ALS(R)-iMGs)头部吞噬过程中肌动蛋白聚合相关蛋白(WAVE复合体成员)和NCKAP1的亚细胞分布。ALS(S)-iMGs中，WAVE(黄色);a)和ABI(黄色;b)与NCKAP1(绿色)、phalloidin(红色;f -肌动蛋白标记)和DAPI反染(蓝色)。箭头表示吞噬杯围绕着一个球体。该图代表了在重复中进行的独立实验(n=10)。比例尺:25 μm。c将人NCKAP1或shNCKAP1转染HeLa细胞，western blot检测肌动蛋白聚合相关基因CYFIP1、ABI2、WAVE1、WAVE2的表达变化。用空shRNA载体作为对照(乱序shRNA)。*代表NCKAP1-GFP。d量化各组归一化为GAPDH的mRNA表达量，并以对照相对表达量表示(n=3)。数值为平均值±SEM。与对照组比较(*P < 0.05， **P < 0.01， ***P < 0.001;采用事后Tukey检验的双向方差分析)。e, f在两组ALS-iMGs中显示乳胶珠吞噬的活细胞成像快照。DIC(乳胶珠)和荧光图像(F-actin:红色;DAPI:蓝色)。ALS(S)-iMGs(上)显示正常的吞噬功能，而ALS(R)-iMGs(下)显示明显的吞噬功能受损(e)。转染shNCKAP1-GFP的ALS(S)-iMGs(上)或转染NCKAP1- gfp的ALS(R)-iMGs(下)的胶乳珠吞噬(f)。ALS(R)-iMGs受损的吞噬功能通过NCKAP1过表达而恢复。从延时图像系列(0 - 5小时)的代表性帧显示。该图代表了在重复中进行的独立实验(n=10)。比例尺:25 μm

　　接下来，为了评估NCKAP1在WAVE复合物稳定性中的作用，我们用gfp标记的NCKAP1或gfp标记的NCKAP1 shRNA转染HeLa细胞，然后进行western blots和RT-qPCR，以确定NCKAP1对肌动蛋白聚合相关蛋白的影响。我们发现，NCKAP1过表达增加了肌动蛋白聚合相关蛋白(CYFIP1、ABI2、WAVE1和WAVE2)的表达，而NCKAP1敲低则降低了它们的表达(图5c和d)。

　　最后，我们利用活细胞成像技术检测了NCKAP1过表达是否挽救了ALS(R)-iMGs有缺陷的吞噬功能。ALS(S)-iMGs吞噬乳胶珠(图5e，上面板)，ALS(R)-iMGs吞噬缺陷(图5e，下面板)。然而，当NCKAP1在ALS(R)-iMGs中过表达时，吞噬功能被恢复(图5f，下面板)。正如预期的那样，当NCKAP1被敲除时，ALS(S)-iMGs中的活性吞噬不存在(图5f，上面板)。总的来说，我们的数据表明，NCKAP1通过参与WRC复合物介导的肌动蛋白聚合过程，在吞噬杯的形成中起着关键作用。因此，NCKAP1是一个重要的潜在生物标志物，可用于预测快速进展的ALS患者iMGs吞噬功能紊乱的状态。

　　传统上认为吞噬作用有利于组织稳态;它负责快速清除死亡细胞或碎片，从而防止促炎和神经毒性反应的外溢[42]。转录组分析显示，免疫反应通路响应LPS和炎症信号，在两个ALS组的img中功能不同，如图4c所示。因此，我们比较了ALS(S)-iMGs和ALS(R)-iMGs中响应LPS刺激的细胞因子mRNA表达水平。在非刺激状态下，两组iMGs的炎症细胞因子(TNF-α、IL-6、IL-1β、TGF-β1和IL-10) mRNA水平无显著差异。然而，LPS刺激引起两组iMGs中促炎细胞因子(TNF-α， IL-6和IL-1β) mRNA表达的增加，特别是ALS(R)-iMGs与ALS(S)-iMGs相比表现出夸张的反应(图6a)。此外，通过ELISA测量iMGs培养基中的细胞因子水平，显示出与mRNA表达谱相似的模式(图6b)。这些发现表明，与ALS(S)-iMGs相比，ALS(R)-iMGs对炎症刺激的反应被夸大了。

　　图6

　　

　　与ALS(S)-iMGs相比，ALS(R)-iMGs对LPS刺激表现出更强的促炎反应。a, b通过qRT-PCR (a)和ELISA (b)评估静息状态下或LPS刺激(100 ng/ml)下ALS(S)-iMGs和ALS(R)-iMGs之间的细胞因子谱比较。每个数据点代表个体-受试者来源的iMGs (ALS(S)-iMGs: n=6;ALS(R)-iMGs: n=5)。c静息状态或LPS刺激下ALS(S)-iMGs和ALS(R)-iMGs中NFκB-p50和NFκB-p65 mRNA表达。每个数据点代表个体-受试者衍生的iMGs (ALS(S)-iMGs: n=6;ALS(R)-iMGs: n=5)。数值为平均值±SEM。与对照组比较(*P < 0.05， **P < 0.01， ***P < 0.001， ****P < 0.0001, ns，无统计学意义;采用事后Tukey检验的双向方差分析

　　为了解决ALS(R)-iMGs中增强的促炎反应是否与NCKAP1表达降低有关，我们研究了关键炎症信号与NCKAP1之间的因果关系。由于我们没有关于NCKAP1在小胶质细胞功能和炎症信号传导中的作用的参考框架，我们推测NCKAP1可能与NCKAP1L表现出类似的作用(NCKAP1样)。NCKAP1L和NCKAP1属于同一家族，结构相似。NCKAP1L在肌动蛋白聚合中起着关键作用。它在造血细胞中选择性表达[44]。最近，NCKAP1L被认为是一种新的吞噬调节因子[45]。此外，NCKAP1L是与NF-κB共同的上游信号，是造血细胞中具有代表性的炎症信号[46]。因此，我们研究了NCKAP1的减少是否参与了ALS(R)-iMGs的NF-κB信号传导。我们在ALS(R)- img中检测了NF-κB信号对LPS刺激的反应。LPS刺激后，ALS(R)-iMGs中NF-κB p-50和p-65 mRNA表达水平上调(图6c)。总之，我们的研究结果表明NCKAP1的减少可能通过NF-κB信号通路与异常夸大的炎症反应有关。这一发现为为什么在ALS(R)- img中存在增强的促炎反应提供了线索。

　　总之，我们的数据表明，ALS(R)-iMGs中出现的吞噬功能紊乱与nckap1介导的肌动蛋白聚合损伤减少有关。事后分析表明，?FS代表ALS的进展速度，与每位患者的NCKAP1 mRNA水平相关。因此，靶向小胶质细胞NCKAP1可能是快速als的替代治疗靶点。

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